原标题： 肠道微生物群与AD的关系研究方法实验分组以表达人
肠道微生物在宿主健康中发挥着重要作用，与许多疾病（如癌症、糖尿病、肥胖、神经发育障碍等）的发生发展密切相关。在这个过程中，大量的代谢物一起产生。肠道微生物的种类和功能对宿主体液和组织中存在的小分子代谢物的种类和数量有重要影响。
本文是武汉大学冯玉琪教授课题组在分析化学上发表的文章《Comprehensive Profiling of Mecal Metabolome of Mice by Integrated Chemical Isotope Labeling-Mass Spectrometry Analysis》。在本文中，作者通过将化学同位素标记与液相色谱-质谱（LC-MS 代谢组学）相结合，重点对粪便样品中的羧基、羰基、胺和巯基代谢物进行了系统分析。研究，建立了小鼠粪便代谢组学数据库。
中文名称：使用同位素标记法对粪便样品中的代谢物进行综合分析研究课题：双转基因小鼠粪便出版期刊：分析化学影响因子：6.785 生物技术应用：LC-MS代谢组学
研究背景
哺乳动物具有多种代谢活跃的肠道菌群。宿主和肠道微生物群之间的动态串扰对于维持宿主稳态至关重要。哺乳动物具有多种代谢活跃的肠道菌群。阿尔茨海默病 (AD) 是一种以进行性认知衰退为特征的神经退行性疾病。越来越多的证据表明，各种途径的代谢紊乱可能介导阿尔茨海默病病理的发病机制和患者认知障碍的发展，而肠道微生物群与 AD 之间的关系仍不清楚。本文采用化学同位素标记结合液相色谱-质谱（LC-MS代谢组学）技术对小鼠粪便代谢物进行综合分析，
研究思路
研究方法
1. 实验分组
28只表达人突变APPK670N/M671N 25和突变psm146l26的APP/PS1双转基因小鼠C57BL/6J（C57）作为AD模型，40只野生型（WT）C57BL/6J小鼠在光照下饲养。控制室（明暗 12 小时），温度为 23°C，可自由获取标准食物和水。
通过从所有 68 只小鼠（混合样品 A）、40 只 WT 小鼠（混合样品 B）或 28 只 AD 小鼠（混合样品 C）中取等量的每种粪便样品来制备混合样品。为每组准备三个独立的合并样本并进行三个测量。
2. 实验程序
图 1 | 小鼠粪便代谢物相对定量方法
Pooled A 是所有样品的混合物，分别与同位素标记和未标记的试剂反应，用于提取目标离子和碎片信息。
3. 试剂的合成
合成同位素标记试剂用于与代谢物中的羧基、羰基、胺和巯基发生特异性反应。该化合物的结构及与代谢物反应的过程如下图所示：
图 2 | 同位素标记试剂与具有不同官能团的代谢物之间的化学反应
由于试剂中不同量的 H 被 D 取代叔胺质谱，固定质量差异分别为 4.025 Da（含有羧基和胺基的代谢物）和 7.044 Da（含有羰基和巯基的代谢物）。
4.质谱检测方法
·使用LC-LTQ-Orbitrap MS进行化合物检测，使用全扫描法获得初级质谱，使用Orbitrap作为质量分析器。扫描后，将检测到的原始数据导入Sieve 2.2软件进行色谱峰提取叔胺质谱，生成色谱峰列表。
·使用Mat lab 处理此色谱峰列表上的数据，并过滤出与目标离子具有相同保留时间、相似峰强度和比质量差的一对离子。
· 对选定的目标离子进行二次串联质谱分析以获得 MS2 信息。
·选择具有特征中性丢失的离子进行碎裂，以获得目标离子的MS3信息。
作者使用这些试剂分别分析了四种不同官能团的化合物标准品，总结了质谱特征和特定的中性损失，结果如下：
图 3 | 试剂反应产物
面板 ACEG 是与未标记试剂反应的产物；panel BDFH 是与标记试剂反应的产物，图中绿色箭头表示特征性失中性。在检测到的代谢物的第二阶段，如果它包含上述特征损失，那么产物离子将被进一步碎片化，产生三级碎片质谱信息。
分析结论
在获取碎片离子的过程中，作者首先根据初级质谱中的特定质量差筛选目标离子，获取其MS2信息。此外，将具有特征中性丢失的碎片离子进一步碎片化以获得 MS3 信息。整个过程消除了背景离子的干扰，缩小了目标离子的范围，使得该方法对目标离子碎片的采集比传统的数据依赖扫描具有更高的灵敏度。
同时，由于反应试剂中含有易电离的叔胺或季胺基团，这些基团的引入也提高了代谢物的电离效率。作者分析了四种不同类型标准品的检出限（信噪比为 3），结果表明，与未反应的代谢物相比，反应代谢物的检出限降低了 5-1250 倍，灵敏度提高也更有利于检测低丰度代谢物，从而提高整体检测覆盖率。
此外，作者建立了一个数据库，使用研究人员鉴定代谢物的标准。最后，作者将该方法应用于AD小鼠代谢生物标志物的发现，以检验该方法的适用性。
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本文采用同位素标记的反应试剂和未标记的反应试剂分别与代谢物反应，提高了检测灵敏度，拓宽了检测范围。同时，反应的特异性也有利于研究人员对化合物的鉴定。
一些参考资料：
(1) 施罗德，BO；Backhed, F. Nat Med 2016, 22, 1079-1089。
(2) 鲁克斯，MG；Garrett, WS Nat Rev Immunol 2016, 16, 341-
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(3) Geva-Zatorsky, N.；塞菲克，E。夸，L。帕斯曼，L。谭，TG；奥尔蒂斯-洛佩兹，A.；.; 马西斯，D。班诺伊斯特，C.；Kasper, DL 细胞 2017, 168, 928-943 e911。
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结尾